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der Zentrifugation freigesetzt werden.In dieser Studie werden elektrogesponnene Poly(ε-caprolacton)-Membranen aus Lösung als Alternative zur Isolierung beweglicher Spermien verwendet, indem ein rational gestalteter 3D-gedruckter Modulaufbau verwendet wird, der die gleichen Vorteile wie kommerziell erhältliche Techniken mit minimaler Verarbeitungszeit bietet und den Zentrifugationsschritt umgeht Spermien höherer Qualität.Die Membranen mit nominalen Porengrößenverteilungen im Bereich von 5 bis 6 &mgr;m sind hochporöse Strukturen, die geeignet sind, Basisdaten für die Sortierung von Spermien nach Beweglichkeit zu erstellen.Das vorgeschlagene Verfahren ermöglicht die Isolierung beweglicher Spermien mit einer Reinheit von 74 %, während die Verarbeitungszeit im Vergleich zu Zentrifugationstechniken um 98 % verkürzt wird.Dieser neuartige Ansatz bietet eine einfache Methode zur Isolierung beweglicher Spermien direkt aus gefrorenen Samenproben ohne Vorbehandlungen und ist für kleine und mittlere landwirtschaftliche Betriebe sowie größere Industrien leicht skalierbar.Die Spermienqualität in Bezug auf eine hohe Erfolgsrate bei der Befruchtung kann auf eine Vielzahl von physikalischen und biochemischen Eigenschaften zurückgeführt werden1.Zu den physikalischen Merkmalen qualitativ hochwertiger Spermien gehören die Beweglichkeit der Spermien, die als Hochgeschwindigkeitsparameter und Flagellenschläge beschrieben werden können2, sowie das Fehlen morphologischer Anomalien im Kopf und/oder Schwanz der Spermien3.Zu den gewünschten biochemischen Eigenschaften von Spermien für die Befruchtung gehören die Reifung der Spermien, bewertet anhand des Zetapotentials4 und der auf der Zellmembran vorhandenen Hyaluronsäure-bindenden Proteine5 sowie des Fehlens apoptotischer Faktoren6.Methoden zur Isolierung von Spermien auf der Grundlage physikalischer und biologischer Eigenschaften wurden entwickelt, die sich auf die Eigenschaften von Spermien stützen, die für assistierte Reproduktionstechnologien (ARTs)7 erforderlich sind.Motilität ist eines der Hauptmerkmale bei der Messung der Lebensfähigkeit von Spermien und der Erfolgsrate beim Durchqueren des weiblichen Fortpflanzungstrakts8 oder anderer ARTs.Die Nachfrage nach der Isolierung von Spermien auf der Grundlage der Beweglichkeit, der Suche nach ihrer Nische im Gesundheitsbereich zur Umgehung männlicher Unfruchtbarkeit9 oder der Aufrechterhaltung von Vaterlinien für hochwertige Tiere und gefährdete Arten10 ist gestiegen.Zu den aktuellen Methoden zur Isolierung beweglicher Spermien aus Samenproben gehören Zentrifugationstechniken wie die Swim-up-Methode und Dichtezentrifugationstechniken11.Bei der Swim-up-Methode werden die Spermien nach unten zentrifugiert und in Lösung redispergiert, und bei der sich schnell bewegende Spermien aus dem Pellet „aufschwimmen“ und isoliert werden können.Bei Dichtezentrifugationstechniken werden die Samenproben auf die Lösungen mit unterschiedlicher Dichte gegeben und die hoch beweglichen Spermien bewegen sich über viskosere Flüssigkeiten und werden anschließend isoliert12.Beide Techniken haben einen hohen Durchsatz, ermöglichen eine schnelle Isolierung und können mit einer großen Anzahl von Spermien durchgeführt werden.Beide Methoden können jedoch auch die biochemische und DNA-Integrität der Spermien schädigen, indem sie reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) ausgesetzt werden, die während des Zentrifugationsschritts von einer Subpopulation von Zellen freigesetzt werden13.Ein weiterer Weg, der beim Sortieren von Spermien nach Beweglichkeit an Popularität gewinnt, beruht auf der Verwendung von mikrofluidischen Geräten, bei denen sich schnell bewegende Spermien isoliert werden, indem die Fähigkeit beweglicher Spermien ausgenutzt wird, gegen den Fluss des Lösungsmittels zu schwimmen, was die Trennung lebender Spermien ermöglicht aus unreifen oder toten Samenzellen sowie anderen Zelltypen.Mikrofluidische Methoden sind in der Lage, sich schnell bewegende Spermien in hoher Reinheit zu liefern, leiden jedoch unter Problemen bei der Probengrößenverarbeitung im Zusammenhang mit der Komplexität bei der Skalierung solcher Geräte14.Membranen werden derzeit in verschiedenen Spermiensortierungsprozessen auf ihre breite Anwendbarkeit in verschiedenen Trennmethoden untersucht, da ihre Porengröße mithilfe verschiedener Membransyntheseprozesse wie Elektrospinning15 oder anderen verfügbaren kommerziellen Techniken16 maßgeschneidert werden kann.Die Verwendung von Polykarbonatmembranen in der Elektrophorese wurde demonstriert, wobei die Spermien basierend auf ihrer Oberflächenladung getrennt werden und der Filter verwendet wird, um einen Rückfluss von Spermien oder anderen Zellbestandteilen in die Lösung zu verhindern17.Nanofasermembranen wurden auch in ein komplexes Gerät eingeführt, um Spermien aus extrahierter DNA abzusieben und bei der Identifizierung von Verdächtigen in Fällen sexueller Übergriffe zu helfen, wie es vom US-Justizministerium finanziert wird18.Kommerziell erhältliche faserige Poly(ester)-Membranvorrichtungen (Pall Biosupport Corporation) wurden an einer Pipettenspitze befestigt, was die Isolierung von beweglichen Spermien aus Samenproben und die Trennung von anderen Zelltypen und morphologisch abnormalen Spermien ermöglichte16.Poly(carbonat) Track Etched (PTCE)-Membranen mit zylindrischen Poren wurden ebenfalls erfolgreich verwendet, um bewegliche Spermien aus Samenproben zu isolieren19.Diese Berichte zur Isolierung beweglicher Spermien schlagen verschiedene Techniken mit unterschiedlichen Konfigurationen vor, gehen jedoch nicht auf die Rolle von Membranen im Trennverfahren ein, insbesondere nicht auf die Untersuchung unterschiedlicher Filtereigenschaften für eine optimale Isolierung.Das Verständnis der Rolle von Filtern bei der Sortierung von Spermien ermöglicht eine ordnungsgemäße Optimierung nicht nur der Membranmorphologie und -eigenschaften, sondern auch der Prozessparameter.Das Ziel dieser Studie ist es, eine neuartige und Standardmethode zur Isolierung beweglicher Spermien unter Verwendung von elektrogesponnenen Poly(ε-caprolacton) (PCL)-Membranen vorzustellen, beginnend mit dem rationalen Design von Modulen für die Trennung bis hin zur Erstellung von Protokollen für die Isolierung von Spermien und Assays zur Bestimmung die Auswirkung der Filtereigenschaften auf die Abscheideleistung und die Verarbeitungszeit.Die Analyse beruhte auf der Bewertung strategischer Parameter wie der Reinheit der isolierten Zellen und der Verarbeitungszeit der Sortiertechnik.Elektrospinnen kann verwendet werden, um hochporöse Membranen mit Porengrößenverteilungen im Submikron- bis Submillimeterbereich herzustellen20.PCL wurde aufgrund seiner hohen Biokompatibilität und Stabilität für eine Vielzahl von medizinischen und zellulären Anwendungen als Basispolymer ausgewählt21.Im Zusammenhang mit der Sortierung von Rinderspermien war ein Porengrößenbereich von 5–6 µm22 erforderlich, damit der Spermienkopf diffundieren und von Epithelzellen und Leukozyten getrennt werden konnte, deren Größen um ~ 15 bzw. ~ 30 µm lagen23.Die Porengröße von elektrogesponnenen Membranen kann mit verschiedenen Prozessparameteranpassungen variiert werden, aber für ein anfängliches Screening in dieser Studie wurde die Konzentration von PCL-Polymer in Lösung variiert, während alle anderen Parameter konstant gehalten wurden.Der Einfluss unterschiedlicher Polymerkonzentrationen auf die Faserdurchmesser und die Porengrößenverteilung ist in Abb. 1 dargestellt, wo eine Erhöhung der Polymerkonzentration sowohl den Faserdurchmesser als auch die Porengröße erhöht, wie in anderen Fällen zu sehen ist24.Die Porengröße des Polymers wurde unter Verwendung eines Kapillarfluss-Porometers bestimmt, wobei die Auftragung des differentiellen Flusses, der der Prozentsatz der Flüssigkeit ist, die durch die Poren geflossen ist, gegen die Porengröße aufgetragen wurde.Eine höhere Differenzströmung zeigt eine größere Anzahl von Poren gegenüber dem entsprechenden Durchmesser an.Es wurde auch beobachtet, dass die mittlere Porengröße von 10,2 auf 11,7 Gew.-% nicht mehr zunimmt, was darauf hindeutet, dass andere Parameter angepasst werden müssen, um Porengrößen von mehr als 6 &mgr;m zu erhalten.Für die Sortierung von Rinderspermien müssen Membranen mit Porengrößen größer sein als die Breite der Rinderspermien, die etwa 5 µm22 beträgt.Daher wurden PCL-Membranen, die bei einer Konzentration von 10,2 Gew.-% gesponnen wurden, mit einer mittleren Porengröße von 5,7 &mgr;m für die nachfolgenden Experimente verwendet.(Oben) SEM-Bilder von PCL-Membranen, die durch Elektrospinnen von (A) 7,1, (B) 10,2 und (C) 11,7 Gew.-% Lösungen erhalten wurden.(D) Porengrößenverteilung für die PCL-Membranen, bestimmt durch Kapillarfluss-Porometer.(E) Verteilung der Faserdurchmesser für 7,1 (---), 10,2 (-) und 11,7 (···) Gew.-% PCL-Membranen.(F) Verhältnis von Faserdurchmesser und Porengröße zur Konzentration der Polymerlösung beim Elektrospinnen von PCL.Die Zeit, die benötigt wird, um bewegliche Spermien aus einer Rohsamenprobe zu isolieren, ist ein wichtiger Faktor, um zu prüfen, ob das vorgeschlagene Verfahren mit kommerziell erhältlichen Techniken bei der Samenverarbeitung vergleichbar ist.Kurze Verarbeitungszeiten für Samenproben verringern die Wahrscheinlichkeit einer Schädigung der Spermien durch eine Vielzahl von Wegen oder das Fehlen von Stimuli, die den Abbau hemmen könnten25.Die Zeit bis zum Erreichen der maximalen Diffusion wurde unter Verwendung des kontinuierlichen Assays und durch Überwachen der Anzahl von Zellen bestimmt, die bei 300 nm über die Membran diffundierten.Fig. 2 fasst die Auswirkung unterschiedlicher Dicken von aus Lösung elektrogesponnenen PCL-Membranen auf die Zeit zusammen, die erforderlich ist, um eine maximale Diffusion zu erreichen.Zur Bestimmung der Spermienkonzentration kann eine maximale Extinktion zwischen 280 und 300 nm beobachtet werden.Daher kann jede Wellenlänge aus diesem Bereich verwendet werden.Zeitverlaufsdiffusion von Bullenspermien unter Verwendung von elektrogesponnenen PCL-Membranen aus Lösung mit unterschiedlichen Dicken (A) 20 µm (B) 40 µm und (C) 60 µm und (D) 80 µm.(E) ist das Diagramm, das die Beziehung zwischen der berechneten Zeit, die erforderlich ist, um die maximale Diffusion (Verarbeitungszeit) zu erreichen, in Abhängigkeit von der Membrandicke (mit einem hohen R2 von 0,983 aus der linearen Regression der experimentellen Daten) veranschaulicht.Die Effizienz des vorgeschlagenen Membranverfahrens bei der Isolierung beweglicher Spermien aus einer Samenprobe wurde unter Verwendung des diskontinuierlichen Assays bewertet.Dieser Assay ermöglicht die gleichzeitige Verarbeitung aufgetauter Samenproben mit mehreren Wiederholungen unter Verwendung von elektrogesponnenen PCL-Membranen aus Lösung.Die Daten der Isolierung beweglicher Spermien unter Verwendung von elektrogesponnenem Lösungs-PCL mit einer Dicke von 20 µm sind in Tabelle 1 zusammengefasst.Die Wechselwirkungen zwischen dem Basispolymer und den Spermien wurden untersucht, indem die Population beweglicher Spermien nach der Filtration unter Verwendung von elektrogesponnenen Lösungsmembranen mit unterschiedlichen Dicken bewertet wurde.Diese Wechselwirkungen würden einen Einblick in die Biokompatibilität der Membran mit Samenzellen geben.Wie in Abb. 3 gezeigt, ist es interessant festzustellen, dass die Leistung der Membranen innerhalb des untersuchten Dickenbereichs (20–80 µm) ziemlich stabil war.Die geeignete Dicke soll unter Berücksichtigung anderer Faktoren wie Druckabfall während der Trennung mit dickeren Membranen, die weiter untersucht werden, entschieden werden.Keine Änderung der Spermienqualität nach der Trennung unter Verwendung dickerer Membranen bedeutet, dass die elektrogesponnene PCL-Membran aus Lösung zwar nicht bewegliche Spermien nicht passieren lässt, aber bewegliche Spermien nicht behindert.Bewegliche Spermienzellpopulation isoliert aus ungefilterten und aus Lösung elektrogesponnenen PCL-Membranen mit unterschiedlicher Dicke (N = 6).Das Sternchen oben zeigt Gruppen ohne signifikante Unterschiede in den Mittelwerten, wie unter Verwendung von Einweg-ANOVA und Tukey-Mehrfachvergleichstest bewertet.Das Design von Trennmodulen erfordert die Berücksichtigung bestimmter Parameter im Hinblick auf eine effiziente Trennung und Technologieübersetzung in einen industriellen Maßstab.Dazu gehören (1) einfache Skalierbarkeit für die Hochdurchsatztrennung (2) die Verwendung von biokompatiblem Material zur Reduzierung von Schäden an Spermien während der Isolierung (3) Modul, das von Benutzern mit oder ohne entsprechendem technischen Hintergrund leicht manipuliert werden kann.Diese Anforderungen können erfüllt werden, indem 3D-gedruckte Module unter Verwendung eines bekannten biokompatiblen Polymers, Poly(milchsäure)26–28, mit gängigen Kunststoffwaren wie Zentrifugenröhrchen und Küvetten kombiniert werden.Die Kammern wurden ursprünglich für die Trennung im kleinen Maßstab konzipiert, und die verschiedenen Konfigurationen wurden je nach den erforderlichen Daten auf verschiedene Experimente angewendet (Abb. 4).Im Gegensatz zu früheren Berichten, bei denen die Diffusion horizontal erfolgt19, nutzt das aktuelle Design die Schwerkraft, da die Diffusion vertikal erfolgt.Dieses Design wurde so konzipiert, dass die Diffusion schneller erfolgt und ein Rückfluss von Spermien verhindert wird, die die Membran bereits passiert haben.Die Verhinderung des Rückflusses verringert die Wahrscheinlichkeit einer Vermischung der Samenzellen, die aufgrund des osmotischen Drucks, der die Richtung beeinflussen kann, in der die Samenzellen schwimmen, bereits in die Permeat- und Zufuhrseite diffundiert sind, wodurch die Reinheit der gesammelten beweglichen Samenzellen erhöht wird.Das Modul für diskontinuierliche Assays wird verwendet, um verschiedene Membranen und Membraneigenschaften zu einem einzigen Zeitpunkt zu vergleichen, wobei die Kammer leicht aus dem Mikrozentrifugenröhrchen entfernt werden kann, um Zugang zu den Spermien zu erhalten, die den Filter passiert haben.In der Zwischenzeit ermöglicht das 3D-gedruckte Zubehör für den kontinuierlichen Assay den konstanten Nachweis von Spermien, die mit einer Küvette und einem UV-Vis-Spektrophotometer über die Membran diffundieren können, was zeitaufgelöste Datenexperimente ermöglicht.Die Verwendung beider Anordnungen ermöglicht die Bestimmung sowohl der Isolationsreinheit von beweglichen Spermien als auch der Zeit, die erforderlich ist, um eine maximale Diffusion von Spermien zu erreichen, die Indikatoren für die Gesamteffizienz des Trennungsprozesses sind.Die Materialien im vorgeschlagenen Trennverfahren sind ebenfalls weit verbreitet und leicht auf größere Probenmengen skalierbar, was ideal ist, wenn die Technologie in einen industriellen Maßstab übertragen wird.Entworfene 3D-gedruckte Module und ihre vorgesehenen Gefäße.Das 3D-gedruckte Modul für den diskontinuierlichen Assay wird in einem Mikrozentrifugenröhrchen verwendet, während eine Küvette für den kontinuierlichen Assay verwendet wird.Prozessdiagramme werden für die jeweiligen Assays gezeigt.Wie aus den Zeitverlaufsdiagrammen (Fig. 2) ersichtlich ist, ist das Diffusionsverhalten von Samenzellen über die aus Lösung elektrogesponnene PCL-Membran konstant, was auf eine konstante Diffusion hinweist und dann bei einer bestimmten Extinktion Plateaus bildet.Dies bedeutet, dass die Diffusion der Spermien unidirektional ist, wenn kein Druck ausgeübt wird.Dieser Mechanismus gibt Aufschluss darüber, dass die Diffusion nicht konzentrationsbegrenzt ist, wo das Gleichgewicht durch konstante Bewegung von Zellen über die Membran erreicht wird, sondern von einem anderen Parameter.Es wird vorgeschlagen, dass diese den Spermien innewohnende Eigenschaft eine hohe Beweglichkeit ist, wobei nur ein Bruchteil der Gesamtpopulation von Spermien die Membran aktiv durchqueren kann.Eine weitere Beobachtung ist, dass die zum Durchqueren der Membran erforderliche Zeit in Bezug auf die Dicke linear zunimmt, was impliziert, dass das Stapeln derselben elektrogesponnenen PCL-Filter aus Lösung die Weglänge, mit der die Spermien durchqueren, nicht wesentlich verändert.Die beobachtete lineare Zunahme der Verarbeitungszeit in Bezug auf die Dicke, während alle anderen Faktoren konstant gehalten werden, zeigt auch, dass das Fouling von Zellen oder anderen Bestandteilen der aufgetauten Samenprobe die Diffusion der Spermien nicht behindert und die Diffusion der Spermien nur von der Zunahme abhängt mittlere freie Weglänge der Spermien, die innerhalb der Grenzen der Trennbedingungen durchlaufen wird.Beim Vergleich dieser Methode mit kommerziellen Zentrifugationstechniken29 gibt es eine signifikante Verkürzung der Verarbeitungszeit bei der vorgeschlagenen Methode, die eine maximale Diffusion bei 77 s erreichen kann, wenn eine elektrogesponnene PCL-Membran mit 20 µm Lösung mit der entworfenen Konfiguration verwendet wird, während die Percoll-Methode 3600 s erfordert.Das vorgeschlagene Verfahren eliminiert auch die Notwendigkeit eines Zentrifugationsschritts, der die Integrität der Samenzelle bewahrt, indem der Kontakt mit reaktiven Sauerstoffspezies vermieden wird.Eine weitere Schlussfolgerung, die aus dem vorgeschlagenen Verfahren gezogen werden kann, ist, dass die Anzahl der Spermien, die durch die Membran diffundieren, mit der Anzahl der beweglichen Spermien in der ursprünglichen Samenprobe übereinstimmt (Tabelle 1).Die Werte der beweglichen Spermien im ursprünglichen Samen und die Anzahl der isolierten Spermien bestätigt weiter, dass es die Spermienbeweglichkeit ist, die es den Zellen ermöglicht, die elektrogesponnene PCL-Membran aus Lösung zu durchqueren, was die Isolierung von schnell schwimmenden Spermien aus aufgetautem Samen ermöglicht.Ein wichtiger Hinweis aus den durchgeführten Experimenten ist, dass die Anzahl der beweglichen Spermien nach der Verarbeitung geringer ist als die Anzahl der diffundierten Zellen, was darauf hindeutet, dass der Gesamtprozess aufgrund der Beweglichkeit einen gewissen Grad an abbauender Wirkung auf die Spermien hat.Der Mechanismus, wie die elektrogesponnene PCL-Membran aus Lösung die Diffusion von unbeweglichen Spermien hemmt, ist noch unklar, aber es kann postuliert werden, dass die inhärente gewundene Morphologie des Filters die unbeweglichen Zellen einfangen kann, was die Isolierung von schnell schwimmenden Spermien ermöglicht .Obwohl die Membran unbewegliche Spermien einfängt, gibt es keine Beweise dafür, dass dies die Isolationseffizienz beeinflusst, was der hochporösen Natur der elektrogesponnenen PCL-Membran aus Lösung zugeschrieben werden kann.Nichtsdestotrotz ist die vorgeschlagene Methode zur Isolierung lebensfähiger Spermien vergleichbar mit bereits kommerziell erhältlichen Techniken29,30, bei denen die nachbearbeiteten Proben etwa 70 % bewegliche Samenprobe enthalten, was insgesamt die Anzahl lebensfähiger Zellen erhöht, die zur Steigerung des Erfolgs verwendet werden können Rate verschiedener ARTs.Daraus kann geschlossen werden, dass dickeres, aus Lösung elektrogesponnenes PCL (bis zu 80 µm, Abb. 3) Spermien nicht benötigen, um mehr Energie 31 beim Durchqueren aufzuwenden, und daher den Gesamtzahlprozentsatz beweglicher Spermien nicht verringert.Keine Änderung der prozentualen Beweglichkeit bei zunehmender Membrandicke zeigt auch an, dass die Biokompatibilität der PCL mit Spermien nicht der Grund für das Vorhandensein von unbeweglichen Spermien in der Lösung nach der Trennung ist, unter der Prämisse, dass nur bewegliche Spermien durch die Lösung hindurchtreten können Membran.Diese Ergebnisse zeigen auch, dass es bei einer Dickenzunahme von 20 auf 80 &mgr;m keine signifikante Änderung des Flusses innerhalb der Membranen gibt.Es sollten jedoch weitere Studien durchgeführt werden, indem der Druckabfall während der Trennung gemessen und eine theoretische Analyse wie z. B. Computational Fluid Dynamics (CFD) durchgeführt wird, um die Auswirkungen von Fouling auf die Membran zu bestimmen.Da die Permeatseite etwa 25 % nicht-bewegliche Spermien enthält, kann der Verlust der Beweglichkeit von zuvor beweglichen Spermien anderen Aspekten im Trennungsprozess zugeordnet werden, wie z. B. Temperaturkontrolle oder plötzlicher Wechsel der Schwimmumgebung.Insgesamt ist eine dünnere, aus Lösung elektrogesponnene PCL-Membran immer noch für das Sortieren von Spermien nach Beweglichkeit erwünscht, da sie eine geringere Verarbeitungszeit als dickere Filter ohne signifikante Erhöhung der Reinheit von beweglichen Spermien hat.Dünne Membranen erhöhen die Gesamteffizienz und verringern die Wahrscheinlichkeit, dass Spermien externen Faktoren ausgesetzt werden, die die biochemische Integrität beeinträchtigen können.Poly(ε-caprolacton) (MW = 80 kDa), Chloroform von AR-Qualität, Methanol von HPLC-Qualität, Natriumhydroxid, vorgemischte phosphatgepufferte Kochsalzlösung bei pH = 7,4 und Rinderserumalbumin wurden von Sigma Aldrich (Australien) bezogen.Bullenspermaproben werden für Total Livestock Genetics (Australien) entnommen.Die Module wurden mit dem Original Prusa i3 MK2s-Drucker mit Filament Poly(milchsäure) (PLA) von Prusa Research (Tschechische Republik) in 3D gedruckt.Das Elektrospinnen von PCL-Membranen wurde in einem HOLMARC HO-NFES-043U (Kalamassry, Kerala, Indien) erreicht.Unterschiedliche Konzentrationen von PCL-Membranen (7,1, 10,2 und 11,7 Gew.-%) für das Lösungselektrospinnen wurden durch Auflösen des geeigneten Gewichts von PCL-Pellets in 25 % Methanol in Chloroform durch Beschallung hergestellt.Die PCL-Lösungen wurden unter Verwendung einer 5,0-ml-Spritze und einer 18-Gauge-Nadel bei 25°C, 11 kV, einer Flussrate von 1 ml/h und einem Abstand von 12 cm von der Nadelspitze zum Dornsammler bei einer Geschwindigkeit von 800 U/min für 90 min geschleudert.Rasterelektronenmikroskopische Bilder wurden unter Verwendung von Jeol NeoScope JCM 5000 (Japan) bei 5 kV erhalten.Vor der SEM-Bildgebung werden Membranen mit 5 nm Goldpartikeln unter Verwendung eines BAL-TEC SCD 050-Sputtercoaters (Leica Microsystems, Australien) beschichtet.Porendurchmesser von 20 &mgr;m dicken Membranen wurden unter Verwendung eines Kapillarflussporometers (3G Zh Quantachrome, Florida, USA) mit einem Druck zwischen 0,04186 bis 0,1674 bar geschätzt.Faserdurchmesser wurden mit imageJ berechnet.Zwei gefrorene Samenproben wurden bei 37 °C für 1 Minute aufgetaut und in 3 % (w/v) wässriger NaCl-Lösung verdünnt, wie in Tabelle 2 gezeigt. Die Extinktion bei 280 nm aller Replikatlösungen wurde dreimal mit einem UV– gemessen. Sichtbares Spektrophotometer (NanoDrop 2000C, ThermoFisher Scientific, USA) und wurden für jede Wiederholung gemittelt.Die Gesamtzahl der Wiederholungen pro Probe beträgt N = 6.Um die Spermienkonzentrationen zu bestimmen, wurden 10-ul-Aliquots 10-fach verdünnt (Probe Nr. 1) und in einem Hämozytomer mit 0,10 mm Höhe montiert, um eine Zellzählung unter einem Phasenkontrastmikroskop Zeiss Axio Lab.A1 zu ermöglichen.Jede Zellzählung wurde zweimal für jede Wiederholung durchgeführt, mit einer Gesamtzahl von N = 6. Die Zellzählung von Probe Nummer 1 wurde verwendet, um die anfängliche Konzentration der Samenprobe zu berechnen, die verwendet wurde, um die Spermienkonzentration in Millionen Zellen zu erhalten pro ml in der nachfolgenden verdünnten Lösung.Lineare Regression wurde verwendet, um das Verhältnis von Extinktionsmessungen und Spermienzellkonzentration zu bestimmen, wobei der y-Achsenabschnitt auf 0 gezwungen wird, um zu berücksichtigen, dass es bei 0 Extinktion keine Spermien gibt.PCL-Membranen wurden unter Verwendung einer Spinnlösungskonzentration von 10,2 Gew.-% für die nachfolgenden Experimente hergestellt.Die anfängliche Membran hatte eine Dicke von 20 µm, gemessen mit einem Mikrometer-Messschieber, und unterschiedliche Dicken der endgültigen Membranmaterialien wurden erreicht, indem mehrere 20 µm zwei- bis viermal übereinander gestapelt wurden, um eine Gesamtdicke von 40, 60 und 80 µm zu erreichen.Das Stapeln dünner Membranen wurde so gewählt, dass die innere Struktur im Gegensatz zur Herstellung dicker Membranen nicht wesentlich verändert wird.Die Membranen wurden in ein 3D-gedrucktes Modul platziert und in Küvetten montiert, die mit 2,5 ml 0,3 % (w/v) BSA in PBS-Puffer, pH = 7,4, gefüllt waren, und wurden vor der Durchführung des Assays bei 37 °C äquilibriert.Das Nanodrop-UV-Visible-Spektrophotometer bei 37 °C mit einer auf 300 nm eingestellten Wellenlängenerkennung wurde verwendet, um die diffundierten Spermien für 900 s oder länger zu erkennen.Die zum Erreichen der maximalen Diffusion erforderliche Zeit wurde berechnet, indem die beste Anpassungslinie, die dem Plateau und der stetigen Zunahme der Extinktion entspricht, genommen und der Punkt berechnet wurde, an dem x beide Gleichungen schneidet.Sechs gefrorene Samenproben von sechs verschiedenen Bullen wurden bei 37 °C für 1 Minute aufgetaut und vor der Spermiensortierung gepoolt.In diesem Experiment beträgt die Gesamtzahl der Wiederholungsmembranen N = 6. Lösungselektrogesponnene PCL-Membranen wurden auf dem 3D-gedruckten Modul montiert, das bei 37 °C in 1 ml 0,3 % (w/v) Rinderserumalbumin ein Gleichgewicht erreichen durfte (BSA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei pH = 7.Nach Erreichen des Gleichgewichts wurden 100-ul-Aliquots von Samenproben in das Modul pipettiert und 30 Minuten lang Diffusion stattfinden lassen.Das Modul wurde dann entfernt und die Samenprobe wurde durch Messung der Extinktion bei 280 nm analysiert und die Anzahl beweglicher Spermien wurde durch Auswertung unter einem Phasenkontrastmikroskop gezählt.Für eine Blindprobe werden 100 µl Sperma mit 1 ml 0,3 % (w/v) BSA in PBS bei pH = 7,4 verdünnt.Eine weitere Verdünnung erfolgte durch Verdünnen von 100 µl der Blindprobe in 100 µl 0,3 % (w/v) BSA in PBS bei pH = 7,4, der Lösung, die zur Berechnung der Anfangskonzentration der Spermien in der gefrorenen Samenprobe durch Messung der Extinktion verwendet wurde und bewerten Sie die Anzahl der beweglichen Spermien in der Population unter einem Phasenkontrastmikroskop.Extinktionsmessungen wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt und das Zählen von beweglichen Spermien wurde in doppelten Messungen durchgeführt, wobei jede Messung die gesamten Spermien in fünf verschiedenen Sichtfeldern unter dem Mikroskop verwendete.Signifikante Unterschiede im Mittelwert für die Reinheit der Isolierung wurden durch Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) und Mehrfachvergleichsanalyse nach Tukey bestimmt.Die Normalität wurde unter Verwendung des Kolmogorov-Smirnov-Tests mit Dallal-Wilkinson-Lillie für den P-Wert und Browne-Forsythe-Test für die Varianzhomogenität bestimmt.Diese Studie schlägt eine neue Methode zur Isolierung beweglicher Spermien aus einer Samenprobe ohne Zentrifugation vor, die die Integrität der Spermien beeinträchtigt, indem sie radikalen Sauerstoffspezies ausgesetzt wird, die von toten Zellen ausgeschieden werden.Die Technik nutzt die Fähigkeit beweglicher Spermien, durch eine elektrogesponnene PCL-Membran aus Lösung zu diffundieren, und ermöglicht die Identifizierung von Schlüsselparametern bei der Bewertung der Effizienz der Trennparameter wie Reinheit und Verarbeitungszeit.Es wurde festgestellt, dass die Reinheit von isolierten beweglichen Spermien mit kommerziell verfügbaren Zentrifugationstechniken vergleichbar ist, wobei die Verarbeitungszeit durch die Verwendung von elektrogesponnenen PCL-Membranen mit 20 µm Lösung drastisch um 98 % abnimmt.Diese Studie erstellt ein neues Protokoll, das im Labor verwendet werden kann, um Effizienzparameter bei der Optimierung von Membranen für die Spermiensortierung weiter zu identifizieren.Das rational gestaltete Membranverfahren lässt sich auch leicht in einen industriellen Maßstab übertragen, was insbesondere für kleine bis mittelgroße Landwirte oder Gesundheitszentren geringes Kapital und Know-how erfordert, um es zu manövrieren.Henkel, R. 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